甘油保存菌种的方法

　　此篇农资汇总会给网友们分享“甘油保存菌种的方法”的内容进行分享，期望对广大农友有所帮助，下面一起来看看吧！

　　准备材料：甘油保存细菌时，准备好甘油、离心管、移液器具，并进行灭菌处理。配比：甘油按菌种配比。

　　一般甘油与菌液的比例为20：80。控制温度：根据冷藏时间，将温度保持在-20度或-70度。

　　注意事项：严格控制温度。

　　甘油保存细菌时，首先要根据需要保存的细菌，准备足够的甘油、离心管、移液器具。

　　其中离心管要准备好2ml的容量，准备好的工具要在121度的环境下灭菌20分钟。

　　根据菌种调配甘油，用20%的甘油保存菌种，则甘油与菌液的比例为20：80，不同菌种的甘油比例不同。

　　例如，保存链球菌时，除甘油外还需要少量生理盐水制成保存液。

　　将纯化后的菌种放入配制好的甘油保鲜液中，冷藏于-20度或-70度的环境中。

　　存放时间因温度而异。零下20度的温度最多只能保存一年。

　　在负70度下储存时间为2-4年。

　　甘油贮藏细菌时，必须进行杀菌处理，严格控制冷藏环境的温度，以免细菌死亡或被污染。

　　用于保存的细菌的特性与标准细菌不同。在1度/分钟。

好文探索：实验室基础：甘油冻存菌、引物、质粒的保存

　　随着科研的深入、课题的进展，我们会从商家**质粒菌种订购引物，我们自己也会构建许许多多的克隆载体。几乎实验室所有人都会产生很多冻存菌、引物及质粒。

　　那么如何保存以及管理这么多的实验产物呢。

　　很多人一定见过上面的白色冻存盒，对于条件好点的实验室其使用的冻存盒可能更高档。一般冻存盒都是9*9格的，可以先对盒子进行编号，1，2，3、

　　等，再对每个盒子内部每小格进行编号，如A1，A2，B1、等。

　　这个任何一个盒子的任意一格都有了唯一的编号对应，如3C8，指的是第三号盒子的C8格。

　　建立好编号之后，再在标准的Excel表格中，建立起位置和冻存物的对应关系。

　　还应记录下冻存菌/引物/质粒的信息(如名称，序号，状态，冻存时间等)。填写好相关信息后，再将冻存菌/引物/质粒放于冻存盒的预定位置，保存到合适温度的冰箱或液氮罐中。

　　这样大家就可以有条不紊的管理自己的“小金库”了，下面我们针对不同类型的冻存物，具体看看其保存方法。

　　按照菌种类型(如DH5α或者表达菌)的不同，分盒保存。

　　冻存盒中的冻存管，可按冻存时间排列。冻存菌保存在-80℃冰箱或液氮罐中。

　　无菌接种环或灭菌枪头，含有合适抗生素或无抗的LB板。

　　实验步骤（PROC**URE）。

　　一般保种用的菌液要求浓一些，因此培养时间可以比平时长一些，一般**即可。在无菌操作条件下，分别向已灭菌的2mL冻存管中，加入500uL菌液和500uL50%甘油溶液，轻轻混匀，务必充分混匀。甘油冻存菌可以直接保存在-80℃中，有时为了减少菌体因冰晶形成而死亡，也会使用液氮速冻之后在放到-80℃冰箱保存。该冻存菌可在此条件下保存数年之久。

　　随后的冻存和融化操作将会减少保存年限。（注意：与菌液接触的物品，如枪头、冻存管、50%甘油溶液均需要处于无菌状态，并保证操作在无菌条件下进行。

　　从甘油冻存菌中复苏细菌，在无菌条件下，打开盖子，使用无菌接种环或灭菌枪头从冻存管中刮取适量冻存菌，划线接种到LB板（含有合适抗生素或无抗）上。操作应适当快一些，以减少冻存管内的融化。

　　在合适的温度条件下，将划线接种的LB板进行**培养。**培养后，挑取单个克隆进行后续操作。

　　（注意：所有东西准备完全后，再去-80℃冰箱取出保种菌，划线动作要快，时间拖得太长会融化冻存菌，而这导致保种菌死亡。）。

　　addgene。/recipient-instructions/create-glycerol-stock/。

　　按照用途，引物分为PCR引物，测序引物。

　　而按照存在状态，引物则分为干粉/薄膜状态、100uM稀释状态、10uM稀释状态（10uM为PCR的通常使用浓度）等三种状态。

　　实验步骤（PROC**URE）。

　　引物一般有两管（均为干粉状态），其中一管可直接保存，而另外一管可稀释其中引物的浓度至10uM（使用浓度）。

　　两管放置可在同一个冻存盒中的相邻位置，按引物序号排列。

　　PCR引物则根据引物的浓度不同（一般只有100uM和10uM两种）进行分盒保存。

　　在每一个冻存盒中，按照引物序号依次排列。引物保存在-20℃冰箱中。

　　先将装有引物的EP管进行离心，g离心1分钟，将干粉或薄膜状态的引物离心至管底。然后，根据引物管上指示的体积，加入对应量的无菌蒸馏水，使用枪头吹打混匀，即可得到浓度为100uM的引物。

　　对其进行10倍稀释，即可得到浓度为10uM的引物。

　　按照用途，质粒一般分为PCR模板型质粒（用于扩增目的基因片段）和蛋白表达型质粒（用于表达目的蛋白）。

　　可按照用途的不同，分盒保存。经常使用的质粒可以保存在-20℃冰箱中，长期保存建议放在-80℃冰箱。

　　对于新构建的质粒或者**回来的载体，建议测序正确后再多提几管，放在-80℃冰箱保存。

　　 还可以将质粒转入合适的感受态菌株中，通过保存菌种的方法达到保存质粒的目的。

精选问答：

　　1、保菌先加菌液还是先加甘油？

　　1.菌种保存方法-20%甘油保存菌种是指甘油:菌液=20:80,800ul菌液加200u灭菌l甘油后的甘油后,充分混匀后,-70度保藏.(注意甘油要慢慢吸)

　　　　2.菌种保存方法-将一般细菌的菌种纯化后接种于普通肉汤管，4～6h增菌后，加入适量甘油一生理盐水保存液，-20℃冰箱保存；链球菌属和奈瑟氏菌属的菌株纯化后接种于血清肉汤管，在5％～10％CO2中经8～10h增菌后，加入适量保存液，80℃低温冰箱保存；真菌菌种纯化后直接取菌洗入肉汤，不做培养，加入保存液后，-20℃冰箱保存。结果在连续3年实验期内，各菌种保存效果良好，且其形态结构、染色特性、生化反应等与标准株相符。 使用甘油生理盐水保存法来保存菌种，各菌种保存时间长，方法简便，特别是使链球菌、奈瑟氏菌和弧菌等需特殊保存方法保存的菌株在一般实验室得以保存。

　　　　3.菌种保存方法-常用的是终浓度10-30%的甘油。

　　　　由于纯甘油十分粘稠，很难定量，一般配成终浓度50%的水溶液，高压灭菌后室温保存即可。使用时按50%甘油:菌液=1:1混合均匀，然后迅速冻结。

　　　　A.先把甘油稀释成50%，然后灭菌

　　　　这样20%的终浓度用400微的菌体加600微的50%甘油混合不就可以啦

　　　　纯的甘油太粘稠啦，用枪不好吸的

　　　　B.终浓度15%。甘油配成80%的浓度，到时候加800微升菌体，200微升甘油就好。

　　2、临时保藏法和甘油管藏法时间？

　　甘油管冷冻保藏法适合中、长期菌种保藏，保藏时间一般2一4年。

　　临时保藏法适合频繁使用的菌种，保藏时间不长，一般半年左右。